5-杂氮胞苷对成人T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域甲基化水平的影响

摘要

目的:研究DNA低甲基化对穿孔素基因mRNA和蛋白表达的影响.方法:密度梯度离心分离正常成人的外周血淋巴细胞,磁珠分离CD4和CD8细胞后进行细胞培养,DNA甲基化抑制剂5-杂氮胞苷(5-azaC)处理.分别提取DNA、RNA和蛋白质.亚硫酸氢钠处理DNA,巢式PCR进行扩增、转化入大肠杆菌,挑取克隆测序.实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测穿孔素mRNA的表达,Western印迹检测穿孔素蛋白量的变化.结果:5-azaC处理后的CD4细胞和CD8细胞穿孔素mRNA和蛋白表达显著高于未处理的CD4和CD8细胞组(P＜0.05).测序结果显示5-azaC处理后的CD4细胞和CD8细胞DNA穿孔素启动子区域的甲基化水平降低,与未处理的CD4和CD8细胞组比较差异有统计学意义(P＜0-05).结论:5-azaC处理后CD4和CD8细胞穿孔素mRNA的表达和蛋白的表达都有显著的增高,这种增高与CD4和CD8细胞穿孔素基因启动子区域出现的低甲基化有关.