松材线虫谷胱甘肽S转移酶Sigma1基因(BxGSTs1)克隆及表达分析

摘要

[目的]谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferases,GSTs)是一类广泛分布于真核生物及原核生物体内的多功能同工酶,在生物机体的有毒物质代谢、亲脂化合物转运、抗氧化应激反应、抗诱变及抗肿瘤等方面发挥了重要作用.克隆松材线虫谷胱甘肽S转移酶Sigma1基因(BxGSTs1),研究BxGSTs1基因特性、组织表达特性及耐药胁迫表达特性.为揭示BxGSTs1基因在线虫有毒物质代谢方面的具体功能奠定基础.也为寻找潜在靶标基因,防治松材线虫病提供理论支持.[方法]基于松材线虫转录组测序结果,利用RT-PCR技术克隆获得松材线虫BxGSTs1基因CDS序列全长并进行生物信息学分析;利用原位杂交技术进行基因组织表达定位分析;利用实时荧光定量PCR技术,对药剂胁迫下BxGSTs1基因的表达进行定量分析;利用RNAi沉默技术及药剂处理试验,对BxGSTs1基因具体功能进行分析.[结果]松材线虫BxGSTs1基因CDS序列全程468 bp,编码155个氨基酸,其编码蛋白含有N端结构域"GST_N"和C端结构域"GST_C_Sigma_like".多序列比对及系统发育树分析显示,BxGSTs1蛋白与秀丽隐杆线虫GST蛋白(NP_494882.2)同源性最高为37％,进化树聚在同一分支上,亲缘关系较近.原位杂交试验表明,BxGSTs1基因主要在松材线虫的食道腺及生殖部位附近表达.qPCR分析显示,BxGSTs1基因在药剂鱼藤酮、盐酸左旋咪唑胁迫时表达均上调.RNAi沉默显示,dsRNA处理抑制了BxGSTs1基因的表达,虫态表型无明显变化.但dsRNA处理后的松材线虫在鱼藤酮和苦参碱药剂胁迫时,出现死亡率增加现象.[结论]从松材线虫中克隆得到1条谷胱甘肽S转移酶Sigma类基因(BxGSTs1),该基因可能在线虫抗氧化应激及解毒耐药机制中发挥重要作用,是线虫防治的潜在药物靶标基因之一.