棉铃虫双重氧化酶HaDuox的序列特征和表达及病原诱导分析

摘要

[目的]探索棉铃虫双重氧化酶在昆虫肠道防御机制中的作用.[方法]克隆棉铃虫HaDuox编码区基因,并利用生物信息学方法分析其编码的氨基酸序列;构建Ha Duox膜外1 117到1 770 bp编码基因的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导表达特异性蛋白;采用实时荧光定量PCR技术分析棉铃虫幼虫不同组织和不同发育时期HaDuox基因的转录水平;通过测定基因相对表达量研究棉铃虫HaDuox基因对苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)诱导的免疫响应.[结果]棉铃虫HaDuox基因开放阅读框长4 497 bp,编码1 498个氨基酸,预测编码蛋白的相对分子量为171.91 kD.HaDuox与家蚕、橘小实蝇、意大利蜜蜂等昆虫的双重氧化酶结构域类似,含有过氧化物酶结构域,钙离子结合域,铁还原结构域,黄素腺嘌呤二核苷酸结合域和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合域.有7个跨膜区,在第29个和第30个氨基酸位点之间存在一个信号肽切割位点.HaDuox膜外片段在大肠杆菌中成功表达约25 kD的重组蛋白.实时荧光定量PCR结果显示HaDuox基因在马氏管和卵期表达量较高.苏云金杆菌侵染棉铃虫幼虫12 h时诱导HaDuox的大量表达,与对照相比,随着侵染时间的延长,其表达量呈现出先升高后降低再趋于稳定的特点.[结论]实现棉铃虫双重氧化酶基因膜外片段的外源表达,并对HaDuox基因序列特征,不同发育时期和组织表达模式,病原诱导表达进行研究,为研究HaDuox在肠道免疫中扮演的角色及棉铃虫响应病原菌侵染的分子机制提供依据.