甜菜夜蛾双重氧化酶基因SeDuox的克隆、表达及功能分析

摘要

[目的]昆虫双重氧化酶(dual oxidase,Duox)介导产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)是调节昆虫肠道微生物动态平衡的重要免疫机制.本研究通过分析甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)双重氧化酶基因(SeDuox)的序列特征与表达模式,RNAi技术探究SeDuox基因沉默对甜菜夜蛾肠道细菌载量的影响,分析SeDuox对苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)的免疫响应,从而明确SeDuox在昆虫肠道免疫调控中的作用,为甜菜夜蛾的综合防控提供新的思路和作用靶标.[方法]利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆SeDuox,序列特征进行生物信息学分析,采用ClustalX和MEGA_X软件构建系统发育树;克隆SeDuox膜外91—1767 bp编码基因SeDuox-OM,利用Bac to Bac表达系统构建Bacmid-SeDuox-OM,脂质体转染法转染昆虫细胞Sf9,表达SeDuox-OM膜外蛋白;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法分析甜菜夜蛾不同组织(围食膜、血淋巴、脂肪体、马氏管、中肠和表皮)和不同发育时期(卵、1—5龄幼虫、雌蛹、雄蛹)SeDuox的表达水平;利用RNAi技术进行功能分析,向4龄幼虫注射SeDuox的dsRNA,以注射绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的dsRNA作为对照,注射48 h和72 h后检测基因沉默效果及肠道细菌载量的变化;向甜菜夜蛾幼虫饲喂Bt,RT-qPCR方法分析SeDuox及相关免疫基因的诱导表达情况.[结果]SeDuox序列全长为4497 bp,编码1498个氨基酸,预测蛋白质的相对分子量为171.62 kD.SMART分析结构域发现SeDuox含有过氧化物酶结构域(peroxidase)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结构域(NAD)、N-端钙离子结合域(EFH)、铁还原酶结构域(Ferric)和黄素腺嘌呤二核苷酸结构域(FAD),与斜纹夜蛾(Spodoptera litura)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)等昆虫的Duox结构域类似.TMHMM分析显示有7个跨膜区,跨膜片段SeDuox-OM在昆虫细胞中成功表达约80 kD的重组蛋白;RT-qPCR分析结果显示SeDuox在甜菜夜蛾4龄幼虫不同组织中均有表达,其中围食膜和中肠表达量较高;在不同发育时期均有表达,但在卵期表达量最高.与注射dsGFP相比,注射dsSeDuox的甜菜夜蛾幼虫在48 h和72 h时,SeDuox表达量分别下调了62.08％和74.94％,肠道微生物载量显著升高.甜菜夜蛾幼虫取食Bt GS3648 h时,SeDuox表达量显著增加,随着侵染时间的延长,其表达量呈现出先升高后降低再趋于稳定的特点.[结论]甜菜夜蛾SeDuox具有保守的结构域,在中肠和围食膜中高表达,SeDuox在宿主肠道免疫调控中起重要作用,可能与抗菌肽基因协同作用抵御Bt的侵染.