豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞改良分离法

摘要

目的 探索一种能提供更多数量并更长时间保留豚鼠单离Ⅰ型前庭毛细胞细胞活性的分离方法.方法 将耳廓反射正常的杂色豚鼠48只随机分为胶原酶Ⅳ+常用分离法组(A组)、胰蛋白酶+常用分离法组(B组)、胶原酶Ⅳ+改良分离法组(C组)和胰蛋白酶+改良分离法组(D组),每组12只,分别用0.25%胶原酶Ⅳ和0.05%胰蛋白酶结合文献报道常用液体和改良液体外加机械分离法分离豚鼠前庭Ⅰ型毛细胞,通过光镜、膜片钳、胞内钙成像等方法观察、鉴定和评价Ⅰ的活性.结果 A组平均每耳分离出存活单离Ⅰ型前庭毛细胞25个,3 h后存活细胞约14个,6 h后存活细胞约8个,3 h静息膜电位平均为-55±10 mV,胞内钙离子浓度平均为105±15 nmol/L;B组平均每耳分离开存活单离Ⅰ型前庭毛细胞40个,3 h后存活细胞约19个,6 h后存活细胞约6个,3 h静息膜电位平均为-60±10 mV,胞内钙离子浓度平均为95±10 nmol/L;C组平均每耳分离出存活单离Ⅰ型前庭毛细胞24个,3 h后存活细胞约为17个,6 h后存活细胞约11个,3 h静息膜电位平均为-55±10 mV,胞内钙离子浓度平均为95±15 nmol/L;D组平均每耳分离出Ⅰ型前庭毛细胞42个,3 h后存活细胞约30个,6 h后存活细胞约23个, 3 h静息膜电位平均为-60±10 mV,胞内钙离子浓度平均为90±10 nmol/L,且胞内钙离子浓度更稳定.结论 与传统的胶原酶Ⅳ酶解加机械分离法相比,以胰蛋白酶酶解结合改良式液体外加机械分离技术分离方法简便易行,能提供足够量的存活时间较长的豚鼠单离Ⅰ型前庭毛细胞,适用于对细胞活性要求较高的实验如膜片钳电生理研究等.