CRISPR/Cas9技术在创制番茄雄性不育株系中的应用研究

摘要

杂种优势利用能极大提高番茄(Solanum lycopersicum)的产量、抗病及抗逆表现,是重要的育种手段.生产上以雄性不育系作为母本能减少人工去雄的工作量.然而,不育系的选育和转育通常需要较长的周期,限制了不育系的品种培育及推广应用.利用现代生物技术编辑番茄雄蕊发育相关重要基因,可以更好地解析番茄雄蕊发育的分子机制,缩短番茄不育系品种的育种年限.番茄中SlAP3 (Solanum lycopersicum APETALA3,SlAP3)是拟南芥(Arabidopsis thaliana)花器官发育APETALA3 (AP3)的直系同源基因,该基因突变导致番茄雄蕊发育异常,形成雄性不育表型.本研究利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统,分别在番茄SlAP3的外显子上选择2个带有前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motifs,PAM)序列的靶点(Targ1 和Targ2),构建入CRISPR/Cas9系统表达载体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化获得番茄T0代转基因植株;通过PCR扩增2个靶位点周围DNA序列后回收条带测序鉴定,获得成功敲除的植株,并对其花器官表型进行观察.研究结果表明,2个载体分别获得20和18株转基因阳性苗,对Targ1和Targ2靶点的10株及9株植物进行克隆及序列比对分析发现,在PAM上游的1～9 bp的碱基处均发生不同的缺失突变,导致SlAP3蛋白序列上的氨基酸缺失及提前终止.植株花器官表型观察发现,纯合突变植株均发生了花瓣、雄蕊等花器官同源异型突变及器官数目减少的表型.本研究利用CRISPR/Cas9系统构建的载体能够特异性地靶向编辑目的基因SlAP3,导致该基因突变,从而形成番茄雄蕊同源异型即雄性不育表型.研究结果为利用CRISPR/Cas9系统创制番茄雄性不育系材料提供了一定的理论指导和技术支持.