猪miR-339-3p靶基因预测分析及部分靶基因验证

摘要

miRNAs (microRNAs)能够在多种生理和病理过程中发挥作用,通过相应的靶基因发挥其生物学功能,通过生物信息学预测和实验验证相结合的方法,可以快速、有效地筛选miRNA靶基因.本课题组前期通过高通量测序发现,ssc-miR-339-3p在仔猪(Sus scrofa)感染C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type C)对照组和攻毒组之间发生差异表达,推测其可能在感染过程中发挥了重要作用.本研究旨在对ssc-miR-339-3p的靶基因进行生物信息学预测和分析,并对ssc-miR-339-3p和预测所得部分靶基因进行验证,探索其影响和调控仔猪腹泻的可能作用机制.利用miRBase、Ensemble、NCBI、miRTarBase等数据库和PITA、RNAhybrid、miRanda、Promoter Scan、Alibaba2.1、DAVID、Cytoscape等生物信息学软件对ssc-miR-339-3p进行转录因子结合位点分析预测、不同物种间保守性分析、靶基因预测、基因本体论(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信号通路富集分析;运用qRT-PCR方法对ssc-miR-339-3p和部分靶基因mRNA表达量进行验证.结果 表明,miR-339-3p在各物种间高度保守;ssc-miR-339-3p启动子区域有Spl、AP-l、C/EBPα、NF-κ3、SRF、USF等多个转录因子结合位点;获得的160个靶基因显著富集于正调控MAP激酶活性、正调控细胞凋亡、负调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、细胞凋亡信号通路等多个生物学过程及NF-κB、PI3K-Akt、FoxO、Toll样受体等信号转导通路.qRT-PCR结果显示,ssc-miR-339-3p表达量在耐受组(resistance groups,IR)和易感组(sensitive groups,IS)显著低于对照组(control groups,IC)(P＜0.05),此结果与高通量测序结果基本一致;靶基因NFKB1和CD40的表达量在IR和IS组极显著高于IC组(P＜0.01);TRAF3和IRAK1的表达量在三组之间差异不显著(P＞0.05).由此推测,ssc-miR-339-3p受到Spl、NF-κB、USF等多种转录因子的调控,其可能通过激活NF-κB、PI3K-Akt、FoxO、Toll样受体信号通路中的靶基因NFKB1、TRAF3、IRAK1、CD40等参与仔猪腹泻的调控.本研究预测和初步验证所得靶基因,可为今后miR-339-3p在仔猪抵抗C型产气荚膜梭菌感染过程中的功能和调控机制提供一定的实验基础和理论依据,对进一步筛选仔猪抵抗C型产气荚膜梭菌病有效的分子遗传标记提供科学依据.