苏云金芽孢杆菌Ly30株cry1Ac基因的克隆及表达

摘要

Bt菌Ly30株是中国自行分离的对多种害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthunngiensis,Bt),经CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences)系统鉴定,它含有cry1Ac基因.以全长基因PCR产物的粘端定向克隆的方法,设计1对特异引物,分别引入Sa1Ⅰ和BamHⅠ酶切位点.以Ly30质粒DNA为模板扩增cry1Ac全长基因,与表达载体pET-21b相应的酶切产物连接,转化大肠杆菌(Eschrichia coli),获得含有cry1Ac基因重组质粒pEKLy1Ac.该基因的亚克隆和序列测定结果表明,其编码区为3 534bp,编码蛋白分子量为133.5kD,含1 177个氨基酸,等电点为4.8,与Cry1Ac3同源性最高,存在4个氨基酸的差异,与Cry1Ac10之间则有6个氨基酸的不同.该基因序列已在GenBank中登记注册为AF482767,并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Ac14.该基因经诱导获得高效表达,SDS-PAGE电泳检测到明显的133.5kD蛋白带.室内生物测定结果表明,诱导表达的Cry1Ac蛋白对棉铃虫、甜菜夜蛾等鳞翅目害虫幼虫均有较高的杀虫活性,其LC50值分别为19.236和3.276μg/g饲料.