5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因AM79 aroA的活性位点分析

摘要

AM79 aroA (WO/2009/059485)基因是从草甘膦高度污染的土壤中克隆的、具有我国自主知识产权的新型草甘膦抗性基因,具有重要应用价值.为进一步解析AM79 EPSPS蛋白的作用机制,本研究对此蛋白的活性位点进行了研究.进化树分析显示AM79 EPSPS属于Ⅰ型EPSPS.序列比对结果表明AM79 EPSPS中第107位的丙氨酸(Ala),第114位的苯丙氨酸(Phe),第355位的Ala和第356位的组氨酸(His)是特异的.采用重叠延伸PCR介导的核苷酸定点突变技术,对这些保守的氨基酸位点进行定点突变.将AM79 aroA及其突变基因转入大肠杆菌(Escherichia coli)aroA缺陷型菌株ER2799中,并进行草甘膦抗性鉴定.结果显示,Phe114、Ala355和His356等氨基酸的突变,使AM79 EPSPS蛋白的草甘膦抗性降低,表明这些氨基酸位点对于维持AM79 EPSPS高抗草甘膦的能力是必需的.同源建模结果表明,这些保守氨基酸位点的突变,使AM79 EPSPS蛋白的结构发生变化,这可能是导致突变蛋白草甘膦抗性能力降低的原因.两个Ⅰ型EPSPS(荧光假单杆菌(Pseudomonas fluorescens)G2 EPSPS和拟南芥(Arabidopsis thaliana) EPSPS)对应氨基酸突变后,其草甘膦抗性没有明显变化,表明AM79 EPSPS中几个特异的氨基酸位点的功能在Ⅰ型EPSPS中并不是保守的.本研究结果为解析AM79 EPSPS高抗草甘膦的作用机理及对AM79 EPSPS进行定向进化提供了理论依据.