构建含绿色荧光蛋白和潮霉素抗性基因重组逆转录病毒载体的实验研究

摘要

目的 构建含增强绿色荧光蛋白(EGFP)和潮霉素抗性(Hyg)重组逆转录病毒载体.方法 将Hyg和EGFP基因片段分别插入逆病毒载体质粒pCMV-LL-SA-2中,构建重组的逆病毒质粒pCMV-EGFP-hyg与质粒pCMV-G和pCMV-GP共转染293T细胞产生重组逆病毒,感染白血病细胞株K562.结果 成功构建重组逆病毒载体质粒pCMV-EGFP-hyg,与质粒pCMV-G和pCMV-GP共转染293T细胞后24 h和48 h,细胞培养上清中的病毒滴度分别为7.5×105CFU/ml和1.5×106 CFU/ml.K562细胞经与产毒293T细胞协同培养感染重组逆病毒后,表达EGFP的阳性细胞比率为59.6%.经Hyg筛选后,98%以上的K562细胞为EGFP表达细胞.结论 成功构建了含EGFP和Hyg的重组逆转录病毒载体,可以产生较高滴度的目的 病毒;并且建立了稳定持久表达EGFP的K562白血病细胞系.