miR-301a靶向调控Smad4介导高糖促进前列腺癌细胞增殖的作用及其机制

摘要

目的:观察miR-301a靶向调控Smad4介导高糖促进前列腺癌细胞增殖的作用及其机制。方法:预测miR-301a的靶基因并转染miR-301a模拟物，分别采用实时定量聚合酶链反应、蛋白质印迹法对miR-301a、Smad4的表达进行检测，并采用流式细胞术对细胞增殖及周期进行分析。结果:通过Pic Tar数据库及TargetScan数据库对miR-301a的靶基因进行寻找，结果显示，Smad4是miR-301a的靶基因。双荧光素酶实验也提示，miR-301a的结合位点是Smad4。miR-301a可与Smad4的野生型3'-UTR结合(但未与Smad4中发生突变的3'-UTR结合)，对荧光素酶活性造成抑制。miR-301a过表达后，可抑制Smad4蛋白，但不影响Smad4的mRNA。加入高糖后会导致Smad4蛋白表达水平明显降低，与miR-301a表达相似，miR-301a抑制物注入到DU145和PC3细胞可改变其抑制作用。转染Smad4 siRNA后DU145和PC3细胞中的Smad4 mRNA均呈低水平表达，致使Cyclin E和Cyclin D1表达呈上升趋势，可增加磷酸化Rb蛋白(ppRb)。上调miR-301a的表达同时转染过表达Smad4的质粒，采用CCK-8实验检测，结果显示，转染96 h后，DU145和PC3细胞的增殖能力明显上升( P<0.05)。在PC3细胞中，转染miR-301a前的细胞周期比例为G0/G1期63.05%，S期27.93%，G2/M期9.37%；转染后的G0/G1期49.96%，S期40.97%，G2/M期9.04%；转染miR-301a前、后的细胞周期中G0和S期的比例比较，差异有统计学意义( P<0.05)；在DU145细胞中，转染miR-301a前的G0/G1期为65.22%，SD期为24.62%，G2/M期为10.35%；转染后为G0/G1期为53.45%，S期为37.65%，G2/M期为10.03%；转染miR-301a前、后的G0和S期比例比较，差异有统计学意义( P<0.05)。沉默DU145、PC3细胞中的Smad4与过表达miR-301a，均可导致细胞周期G1期缩短，S期延长。另外，miR-301a诱导的G1/S期转化可被Smad4过表达阻断。 结论:Smad4是miR-301a的靶基因，miR-301a靶向调控Smad4介导高糖促进前列腺癌细胞增殖的作用机制主要是通过对Smad4和miR-301a通路进行抑制，对高血糖诱导的前列腺癌细胞生长起到阻断作用。