乳鼠窦房结细胞原代培养方法的优化

摘要

目的:对乳鼠窦房结细胞原代培养方法进行改进,并观察超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN4)在心脏细胞上的表达特点. 方法:取新生SD乳鼠的窦房结组织,在传统乳鼠窦房结细胞原代培养方法的基础上进行优化改进,选用0.1％胰蛋白酶与0.1％Ⅱ型胶原酶按照1∶1制成的混合消化酶,以减少窦房结自律细胞的损伤,混合酶消化后采用差速贴壁法及5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Brdu)纯化处理.通过免疫荧光实验观察HCN4在乳鼠心脏细胞上的表达情况. 结果:(1)本方法培养的心脏细胞存活率为95.8％.(2)经差逮贴壁、5-Brdu处理,窦房结细胞所占比例明显提高.(3)培养3～5 d,视野中绝大多数为搏动的心脏细胞,成纤维细胞无明显增殖,可观察到梭形、三角形和不规则形3种细胞.其中梭形细胞所占比例最高,其细胞器不发达,糖原颗粒不丰富,肌原纤维较少,搏动频率最快,表达HCN4;三角形细胞微量表达HCN4. 结论:(1)混合消化酶结合差速贴壁及5-Brdu处理,可以显著提高细胞成活率及窦房结梭形细胞的比例,是可靠的窦房结细胞的分离纯化方法.(2)搏动频率快、细胞器不发达、糖原颗粒少、HCN4表达阳性的梭形细胞可能就是窦房结的起搏细胞.