利用CRISPR/Cas9和piggyBac实现果蝇基因组无缝编辑

摘要

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9)是第三代基因组编辑技术.在sgRNA引导下,Cas9核酸内切酶作用于特定基因组序列,产生DNA双链断裂(double-stranded breaks,DSBs),利用同源定向修复(homology-directed repair,HDR)可实现对靶基因的特异性基因敲除(knock-out)或敲入(knock-in).传统的技术方案将CRISPR/Cas9技术与Cre/loxP或FLP/FRT系统联用,可实现高效的基因打靶,也易于移除打靶过程中引入的筛选标记.然而,筛选标记移除过程中会在基因组中残留34个碱基的标签序列.因此,对基因组进行精确编辑的同时不引入无关序列仍有一定难度.在人工诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的基因组编辑中,CRISPR/Cas9技术和piggyBac转座酶联用的两步法策略能够实现这一目标:首先运用CRISPR/Cas9技术,利用同源定向修复原理引入基因突变及筛选标记,然后利用piggyBac转座酶将筛选标记精确移除.借鉴该方法的技术原理,本研究对果蝇(Drosophila melanogaster)CG4894基因进行了无缝编辑(seamless genome editing),成功将该基因第18外显子上第21位的酪氨酸(tyrosine,Y)突变为半胱氨酸(cysteine,C),且测序结果显示基因组中除设计位点之外并无其他外源序列残留.CRISPR/Cas9技术和piggyBac转座酶联用策略为果蝇基因组的精确编辑提供了更多选择.