红曲霉原生质体的制备、再生及其遗传转化系统

摘要

原生质体是研究和建立真菌遗传转化系统的重要工具.为了建立原生质体介导的红曲霉遗传转化系统,考察了各种细胞壁裂解酶和渗透压稳定剂等对红曲霉原生质体形成和再生的影响.将红曲霉分生孢子在铺有玻璃纸的平板上30℃培养30～40 h收获的菌丝体最有利于原生质体的形成和释放.红曲霉菌丝体形成和释放原生质体最适裂解酶和酶解时间分别为:0.3%lysing enzyme、0 1%cellulase和1%snailase的酶组合,30℃作用2.5h;最适渗透压稳定剂是:1 mol/L MgSO4.最适合原生质体再生的培养基为含0.6 mol/L蔗糖的CM培养基.原生质体液涂布单层再生培养基的方法,再生率最高,菌株M34和N18分别为8.5%和36.4%.在PEG和CaCl2存在下,以潮霉素B为抗生素选择标记,用质粒pBC-Hygro和pNL1共转化菌株M34原生质体,每微克DNA可获得100个稳定转化子.