大肠杆菌细胞周质底物结合蛋白gsiB基因的克隆及其表达条件的优化

摘要

为深入研究大肠杆菌谷胱甘肽转运系统的蛋白质结构和功能,对该系统中的gsiB基因进行了克隆和表达条件的优化.根据大肠杆菌谷胱甘肽转运系统中底物结合蛋白gsiB基因序列,利用PCR方法扩增到该基因的编码区序列,利用SLIC (Sequence and ligation-independent cloning)方法直接将其插入pWaldo-GFPe中,成功构建了重组表达质粒pWaldo-GFP-GsiB.将重组质粒转化不同的大肠杆菌表达菌株进行诱导表达,通过改变培养温度和IPTG浓度等条件,得到了能够大量表达目标蛋白的重组子.结果表明:大肠杆菌BL21(DE3)是 gsiB基因表达的最佳宿主菌;18℃低温诱导培养有利于gsiB基因的大量表达;0.1 mmol/L IPTG足够诱导gsiB基因表达,增加IPTG浓度(0.1 mmol/L～1.0 mmol/L)并不能明显地促进gsiB基因的表达.Western blotting结果显示目标蛋白质有表达,其分子量大小与预期相符.