华支睾吸虫含串联重复序列的Cs22抗原蛋白的克隆及特征分析

摘要

目的通过免疫学筛选华支睾吸虫成虫λ-ZAP cDNA表达文库和EST数据验证,寻找新的抗原基因,并对其免疫学特征进行初步鉴定。方法使用华支睾吸虫病患者混合血清筛选获得阳性噬菌体克隆,测序后与EST数据进行比对,逆转录PCR(RT-PCR)获得Cs22全长基因序列。PCR跳跃技术获得重复序列次数为2和3次的cDNA片段,将含成熟肽和串联重复序列部分分别克隆至原核表达质粒pET28a(+)中,转化至宿主菌后,诱导表达获得重组蛋白rCs22-2r、rCs22-3r、rCs22M-2r和rCs22M-3r,使用组氨酸标签亲和纯化柱(Ni-NTA树脂)纯化。ELISA法鉴定重组蛋白rCs22-2r和rCs22-3r的免疫原性;检测35份华支睾吸虫虫卵粪检阳性的患者血清,15份日本血吸虫病、15份卫氏并殖吸虫病和13份猪囊尾蚴病的患者血清以及31份健康人血清,评价重组蛋白rCs22-2r和rCs22-3r的免疫学诊断价值。使用仅含串联重复多肽序列部分重组蛋白rCs22M-2r和rCs22M-3r,ELISA法分别检测华支睾吸虫病患者和健康人混合血清的特异性抗体,初步确定抗原决定簇位置。结果获得华支睾吸虫Cs22抗原基因的全长序列,其含有EQQDGDEEGMGGDGGRGKEKGKVEGEDGAGEQKEQA 36个氨基酸组成的串联重复多肽序列,共重复13次。生物信息学分析表明,Cs22蛋白为GPI锚定蛋白。ELISA结果显示,重组蛋白rCs22-2r和rCs22-3r具有一定的免疫原性;ELISA检测血清特异性抗体结果显示,华支睾吸虫病患者血清和健康人血清的阳性率均分别为45.7%(16/35)和3.2%(1/31),与日本血吸虫病和猪囊尾蚴病患者血清无交叉反应,与卫氏并殖吸虫病患者血清仅1份有交叉反应。ELISA法检测重组蛋白rCs22M-2r和rCs22M-3r结果显示,两者能区分华支睾吸虫病患者血清与健康人血清。结论获得华支睾吸虫Cs22抗原基因全长序列,其重组抗原蛋白具有一定的免疫学诊断价值,抗原决定簇位于串联重复多肽。