松材线虫细胞色素cyp-13A11基因RNA干扰载体的构建及其功能分析

摘要

【目的】构建松材线虫cyp-13A11基因RNA干扰载体,研究cyp-13A11基因的功能,为松材线虫病的生物防治提供理论依据。【方法】本文通过设计特异性引物,扩增松材线虫cyp-13A11基因片段,构建至pEASY-T1干扰载体上并转入Trans1-T1大肠杆菌菌株。采用浸泡法对松材线虫进行RNA干扰,通过qRT-PCR检测cyp-13A11基因的表达,将干扰后的线虫分别接种至长满灰葡萄孢菌丝的培养皿中和黑松苗上,测定RNA干扰后线虫的取食、繁殖、致病力和干扰效率等指标。【结果】成功构建了带有pEASY-T1干扰载体的Trans1-T1菌株并且能够合成cyp-13A11 dsRNA,通过RNA干扰抑制了松材线虫cyp-13A11基因的表达。松材线虫RNA干扰后接种至灰葡萄孢第3天,cyp-13A11 dsRNA处理松材线虫的取食面积较小,ddH2O处理松材线虫取食面积达到了整体的2/3;接种第6天,cyp-13A11 dsRNA处理松材线虫的取食面积为整体的1/3,而ddH2O处理松材线虫已将灰葡萄孢菌丝取食殆尽。ddH2O处理松材线虫的繁殖数量比cyp-13A11 dsRNA处理高4.28倍。松材线虫接种至黑松苗第10天,ddH2O处理黑松发病率为22.2%,而cyp-13A11 dsRNA处理黑松发病率为5.6%;接种至20天,ddH2O处理的黑松发病率为44.4%,cyp-13A11 dsRNA处理的黑松发病率为33.3%;直至接种30天,ddH2O和cyp-13A11 dsRNA处理的黑松全部枯萎,发病率达到100%。【结论】成功构建了松材线虫cyp-13A11基因RNA干扰载体,cyp-13A11基因表达沉默后影响了松材线虫的取食,降低了松材线虫的繁殖能力和致病力。