靶向人类心脏发育候选基因hole的siRNA真核表达载体的构建和鉴定

摘要

目的利用siRNA表达载体构建靶向人类心脏发育候选基因hole的pSUPER RNAi载体系(pSUPER-hole)及筛选稳定产毒的细胞克隆。方法化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向人类心脏发育候选基因hole的寡核苷酸链60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、XhoⅠ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pSU-PER-hole)。通过双酶切鉴定及测序分析验证构建效果。将正确构建的质粒转染大鼠心肌细胞H9c2,经过puro抗生素的筛选,建立稳定产生逆转录病毒的细胞模型,采用RT-PCR检测其抑制效果。结果 pSUPER-hole载体经双酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。重组载体转染包装细胞,筛选的细胞克隆均可表达绿色荧光蛋白,表明包装成功。RT-PCR检测表明pSUPER-hole能成功抑制hole基因的表达。结论靶向人类心脏发育候选基因hole的siRNA真核表达载体构建成功。