快速培养纯化猪角朊细胞及复合羊膜体外培养实验研究

摘要

目的研究快速培养和纯化猪角朊细胞的方法及观察角朊细胞在脱细胞羊膜上的生长状况,为组织工程皮肤研究提供实验依据。方法采用加10%胎牛血清的人无血清角朊细胞培养基(definedkeratinocyte-SFM,DKSFM)培养原代猪角朊细胞,分别用DKSFM(A组)、加5%胎牛血清的DKSFM(B组)、加10%胎牛血清的DKSFM(C组)培养传代猪角朊细胞,于接种后1、3、5和7d观察猪角朊细胞的形态及生长曲线。利用猪角朊细胞与培养瓶黏附牢固的特点,用0.02%乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)和0.05%胰蛋白酶分步消化,纯化细胞。将第2代猪角朊细胞接种在冻干脱细胞羊膜上,直接苏木素染色、石蜡切片、免疫组织化学染色等方法观察猪角朊细胞在脱细胞羊膜上的生长状况。结果采用加10%胎牛血清的DKSFM培养原代猪角朊细胞,细胞生长速度快,形态好,培养5d铺满培养瓶底60%～70%。B组培养的传代猪角朊细胞生长速度较C组培养猪角朊细胞生长速度快。A组培养传代的角朊细胞,细胞生长缓慢。用0.02%EDTA和0.05%胰蛋白酶分步消化的方法纯化猪角朊细胞,可获得纯度为95%以上的猪角朊细胞。将第2代猪角朊细胞接种在脱细胞羊膜后12d,可形成单层细胞,呈多角形、铺路石样排列;14d和16d细胞进一步密集,16d细胞出现老化。结论10%胎牛血清的DKSFM培养原代猪角朊细胞,5%胎牛血清的DKSFM培养传代猪角朊细胞,细胞生长速度快。用0.02%EDTA和0.05%胰蛋白酶分步消化的方法纯化猪角朊细胞,可以获得高纯度猪角朊细胞。脱细胞羊膜为猪角朊细胞提供良好的支架,接种培养后12d,细胞形态最好。