逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测轮状病毒

摘要

为了给轮状病毒感染的诊断和流行病学研究提供更为敏感和可靠的手段，选取Ａ组轮状病毒ＶＰ７基因上的２段高度保守序列作为引物，在优化逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）条件的基础上，建立了检测轮状病毒的ＲＴ－ＰＣＲ方法。通过对比试验，确定了ＰＣＲ的最优模式：９４℃变性１ｍｉｎ→５５℃退火１ｍｉｎ→７２℃延伸２ｍｉｎ，３０个循环后再在７２℃下延伸１０ｍｉｎ。用此模式进行了ＲＴ－ＰＣＲ的特异性和敏感性试验。检测的６株轮状病毒分离株（牛ＨＮ－７、ＢＲＶ００７、ＢＲＶ０１４、ＢＲＶ６５５５、猪Ｌｉ９９、Ｎａｎ８６）及２株参考株（牛ＮＣＤＶ、猴ＳＡ１１），都能扩增出唯一的３４２ｂｐ的目的条带；对猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）及传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）感染猪的粪样、正常ＭＡ１０４细胞检测结果均呈阴性；检测的敏感度可达１ｐｇ水平。对４０份猪、牛、兔的腹泻粪样检测，３０份呈阳性，而用作平行对照的夹心ＥＬＩＳＡ法检测，有２５份呈阳性，两者符合率为８７．５％。两法检测不符的５份粪样的ＰＣＲ扩增产物，用地高辛标记探针进行了斑点杂交，结果均呈阳性，表明ＲＴ－ＰＣＲ法比ＥＬＩＳＡ法敏感性高。