禽致病性大肠杆菌O1、O2、O78血清型三重PCR检测方法的建立

摘要

[目的]本试验旨在建立一种能同时检测禽致病性大肠杆菌O1、O2和O 783种血清型的三重PCR检测方法。[方法]根据O1、O2和O 783种血清型的特异性基因片段设计并合成引物,分别提取O1、O2和O 78血清型禽致病性大肠杆菌的DNA作为模板,优化三重PCR反应条件,进行特异性和敏感性检测,并对临床模拟样品进行检测。[结果]在三重PCR的25μL反应体系中,dNTP 1.5μL,MgCl 22.5μL,Taq DNA酶0.6μL,O1、O2、O78最佳引物加入量分别为0.6、0.2、0.6μL;最佳退火温度为55.9℃。三重PCR的特异性好,3种血清型之间无交叉反应;对146株不同血清型的大肠杆菌进行检测,准确率为99.32%(145/146),用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草芽胞杆菌进行特异性检测时,没有出现非特异性扩增。三重PCR敏感性高,以单一血清型DNA为模板时,O1和O2血清型的DNA最低检测限均为0.1 ng·μL^-1,O 78血清型的DNA最低检测限为0.02ng·μL^-1;以O 1、O2和O78混合DNA为模板时,最低检测限为0.05ng·μL^-1。对18份临床模拟样品进行检测,准确率为94.4%(17/18)。[结论]建立了一种能同时检测O1、O2和O783种血清型禽致病性大肠杆菌的三重PCR方法,方法特异性好,敏感性高,适用于临床上禽大肠杆菌病的快速检测。