hIGF-I基因转染体外培养半月板细胞的转染条件筛选

摘要

目的探索FuGene6介导重组质粒pIRES2-EGFP-hIGF-I转染半月板细胞的转染条件。方法切取成年山羊半月板,剪碎后II型胶原酶消化,离心收集细胞。1×105/孔接种6孔细胞培养板,37℃、5%CO2、饱和湿度培养。绘制生长曲线并行台盼蓝染色。用FuGene6介导,将真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-I转染第二代半月板细胞,设定2∶1、3∶1、3∶2、6∶1转染比例。分为透明质酸酶处理实验组和不处理对照组。又分为将混合物直接加入培养基或将培养基吸除后加入。在不同时间用倒置荧光显微镜观察EGFP的表达并计算转染效率。加入终浓度为100mg/L～600mg/L的G418培养基筛选。结果半月板细胞形态为长梭形和多角形混合。转染后4h即有EGFP表达,至48h达高峰。各比例以3∶1组最高;其次为6∶1;2∶1组与3∶2组最低。用透明质酸酶处理的转染效率均略高于未处理组。将混合物直接加入培养基或将培养基吸除后加入混合物,两种方法效率无明显差异。400mg/L的G418终浓度符合筛选标准。筛选2周可形成阳性克隆。结论利用FuGene6可以有效介导重组质粒pIRES2-EGFP-hIGF-I转染体外培养的半月板细胞,以3∶1为最佳比例,采用透明质酸酶处理可以提高转染效率。