鸡贫血病毒全基因组点突变体的体外构建及其在宿主细胞MSB1的转染研究

摘要

在已构建鸡贫血病毒 (CAV)全基因组体外克隆 (pCAV2 4)的基础上 ,设计一对特定引物 ,用PCR定向点突变方法扩增出含有完整的EcoRI位点的CAV全基因组 (2 3kb) ,并克隆入pUC18载体中 ,获得阳性克隆 ,命名为pCAVE+ 。经酶切鉴定和序列分析EcoRI位点两侧序列 ,原先不完整的EcoRI位点 ( GACTTC )已被定向点突变为完整的EcoRI位点 ( GAATTC )。对重组质粒pCAVE+ 以EcoRI酶切回收CAV全基因组DNA ,在体外连接并经纯化后 ,经Effectene转染易感宿主细胞MSB1。将转染细胞培养上清连续传代 8次以后 ,出现病毒复制 (MSB1细胞培养基颜色不再变黄 )。取此时细胞培养液感染无CAV的 1日龄SPF小鸡 ,14天出现典型的鸡贫血症状和胸腺萎缩、骨髓脂肪变性等病变。获得了能在体外自主复制并组装成完整CAV病毒子的感染性核酸。