hGM-CSF基因在哺乳动物细胞中稳定转染表达质粒的构建和鉴定

摘要

目的：获得具有天然糖基化结构的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）。方法：采用含ｓＲα启动子和新霉素抗性基因的真核细胞表达载体ｐＭＥｎｅｏ，接上ＸｈｏＩ接头，与ＸｈｏＩ酶切ｈＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ片段连接，构建了可在哺乳动物细胞中稳定表达的ｐＭＥｎｅｏ－ｈＧＭ－ＣＳＦ质粒。结果：２２个ｐＭＥｎｅｏ重构载体克隆中，８个含有ｈＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ片段，酶切鉴定插入方向为５个顺式，１个顺式串珠，２个反式。结论：将上述各式以ＤＥＡＥ法转染ＣＯＳ细胞，瞬时表达鉴定，用ＴＦ１细胞ＭＴＴ法测定培养液上清的ｈＧＭ－ＣＳＦ活性，顺式和顺式串珠培养上清活性为１×（１０３～１０４）Ｕ／ｍｌ。