‘赤霞珠’葡萄果实中儿茶素没食子酰基化转移酶蛋白的纯化与鉴定

摘要

【目的】对参与‘赤霞珠’葡萄果实中催化1-O-β-D-没食子酰葡萄糖(1-O-β-D-glucogallin,βG)和表棓儿茶素(Epigallocatechin,EGC)生成表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)相关儿茶素没食子酰基化转移酶(epicatechin:1-O-galloyl-β-D-glucose O-galloyltransferase,ECGT)蛋白进行纯化与鉴定。【方法】以安徽萧县葡萄园种植的‘赤霞珠’葡萄果实为材料,采用丙酮沉淀、硫酸铵分段盐析、亲和柱层析、羟基磷灰石柱层析及Superdex200凝胶过滤色谱方法对ECGT酶蛋白进行分离与纯化,基于高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)技术测定以上各步纯化后获得的ECGT酶蛋白的比活力,并采用SDS-PAGE(SDS-Polyacrylamide Gelelectrophoresis,SDS-PAGE)电泳对Superdex200凝胶过滤色谱纯化后获得酶蛋白进一步分离与纯化,然后基于高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术(HPLC-electrospray ionization mass spectrometry,HPLC-ESI-MS/MS)对目的条带(55 ku,28ku)进行鉴定;另外,进一步采用定量反转录-聚合酶链式反应(quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术对预测的ECGT酶蛋白相关基因及其上游3个糖苷转移酶基因(glucosyltransferase GT_(1-3))在果实不同发育时期的表达水平进行研究。【结果】以上蛋白纯化技术均能有效纯化ECGT酶蛋白,获得的ECGT酶蛋白比活力分别为0.32、3.14、11.78、31.80和88.82 U·mg^(-1),纯化倍数分别为9.81、36.81、99.38和277.56倍,酶活总回收率分别为83.33%、4.64%、0.96%和0.13%。对酶蛋白2条目的条带鉴定结果表明,丝氨酸羧肽酶-类酰基转移酶(serine carboxypeptidase-like acyltransferases,SCPL acyltransferases)家族中一条酶蛋白(XP_002272116.1)比对的分值均最高。此酶蛋白的相关基因SCPL及其上游相关3个基因GT_(1-3)表达均与‘赤霞珠’葡萄果实发育呈显著负相关。【结论】‘赤霞珠’葡萄果实存在ECGT酶蛋白,属于SCPL类酰基转移酶家族,且可能以基因簇的方式行使其功能。