半定量RT-PCR法检测原代培养脂肪细胞生脂基因mRNA转录表达

摘要

在原代培养脂肪细胞生脂机制研究中,为了检测生脂基因ACC l和FAS mRNA表达水平变化,细胞总RNA经反转录合成cDNA,以β-actin为内参照,分别与ACC l和FAS等基因同管扩增。通过探讨和优化PCR体系中引物设计、退火温度、MgC l2浓度和循环次数等参数,以及引物对间的扩增竞争,建立了检测脂肪细胞生脂相关基因mRNA表达的半定量多重RT-PCR体系。结果显示,RT-PCR产物经电泳后,β-actin及生脂基因电泳带清晰,与预期产物大小一致,引物对间无扩增竞争,其扩增效率和特异性与单重RT-PCR体系相同,实验重复性好。因此,该方法和体系可用于快速、灵敏、可靠地检测特异基因mRNA的表达。