四个亚群禽白血病病毒微滴式数字RT-PCR检测方法的建立

摘要

建立一种A、B、J、K亚群禽白血病病毒(ALV)微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法。根据ALV pol基因序列设计特异性引物探针,优化ddPCR方法的反应条件,并评估其敏感性、特异性和重复性。结果显示:引物和探针浓度分别为900和250 nmol/L、退火温度为55℃时ddPCR反应效率最高,该方法检出限和定量限分别为1.999和6.664 copies/μL,通过梯度稀释得到的标准曲线的相关系数为0.994 1,不与常见的禽病毒发生交叉反应,重复性好,ddPCR方法的最低检测限约为1 copies/μL,相同测试条件下,qPCR方法的最低检测限约为100 copies/μL,ELISA方法的检测限约为1×10^(4)copies/μL。结果表明:建立的ddPCR方法的灵敏度高于qPCR和ELISA方法,可用于A、B、J、K亚群ALV的临床检测以及定量检测。