基于ELISA与NMR方法的降钙素基因相关肽抗体的抗原表位鉴定

摘要

目的建立基于间接ELISA法的肽扫描与核磁共振光谱(nuclear magnetic resonance,NMR)技术相结合的方法,鉴定降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)抗体的抗原表位。方法以CGRP各截短片段为包被抗原,间接ELISA法测定2种抗体(新CGRP抗体和对照抗体)与各抗原的结合活性,根据四参数曲线的EC50值分析线性抗原表位。NMR技术采集CGRP的二维氢-氮相关(2D1H-15N HSQC)谱,利用抗体对核磁信号的扰动,分析抗体与CGRP上精氨酸的结合。液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrum,LC-MS)和NMR技术检测精氨酸专属性修饰,通过修饰速率的比对,获得CGRP上2个精氨酸的信号指认。结果2种抗体与CGRP(1-37)、CGRP(19-37)、CGRP(25-37)均存在量效关系,且符合四参数方程,但与CGRP(1-18)、CGRP(19-24)、无C-端酰胺的CGRP(25-37)均无量效关系;确定2种抗体的线性抗原表位均位于CGRP的C-末端。CGRP与对照抗体结合后,2D1H-15N HSQC谱中精氨酸ε-NH的信号消失;CGRP与新抗体结合后,精氨酸信号依然存在;确定抗原上的精氨酸R11和R18可与对照抗体结合,但不与新抗体结合。通过修饰速率的排序比对获得精氨酸ε-NH信号归属,即信号A对应R11,信号B对应R18。结论本研究采用ELISA法与NMR技术相结合鉴定了新CGRP抗体及对照抗体的线性表位和构象表位,为设计新的靶向CGRP抗体药物提供了理论依据。