基于网络药理学研究汉黄芩素治疗糖尿病视网膜病变的机制

摘要

目的 基于网络药理学筛选汉黄芩素治疗糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）的特征靶点和分子通路，并通过细胞实验对关键靶点进行初步验证，阐述汉黄芩素治疗DR的作用机制。方法 利用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP）筛选出汉黄芩素的作用靶点，利用比较毒理学数据库（Comparative Toxicogenomics Database, CTD）、人类基因功能和网络分析数据库（Human Gene Function and Network Analysis Database, GenCLiP）、DisGeNET和GeneCards数据库筛选出DR的相关作用靶点，利用STRING数据库及Cytoscape 3.6.1软件构建蛋白相互作用网络（Protein-Protein-Interaction-Network, PPI）,利用注释可视化和集成发现数据库（Database for Annotation Visualization and Integrated Discovery, DAVID）对靶点进行基因本体（Gene Ontology, GO）注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）信号通路富集分析。最后通过汉黄芩素干预高浓度D-葡萄糖诱导ARPE-19细胞病变模型实验初步验证相关通路中的核心靶点，在光镜下观察细胞形态，用细胞增殖及毒性检测试剂盒（cell counting Kit-8,CCK8）检测细胞存活率，采用实时荧光定量聚合酶链反应（real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）法分析靶点基因的表达量。结果 筛选出汉黄芩素的潜在靶点204个，与DR相关的靶点313个，汉黄芩素靶点与DR靶点交集后获得30个核心靶点。GO富集分析显示，汉黄芩素主要涉及渗透胁迫响应、膜筏和胰岛素受体底物结合等生物过程。KEGG靶点分析显示，糖尿病并发症的晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体（advanced glycation end-advanced glycation end receptor, AGE-RAGE）、内分泌抵抗、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）酪氨酸激酶抑制剂抵抗和白细胞介素-17（interleukin-17,IL-17）等信号通路基因富集较多。最后，通过体外ARPE-19细胞实验成功验证糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路中蛋白激酶B（protein kinase B,AKT1）、B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma 2,BCL2）和胱天蛋白酶3（caspase-3,CASP3）是重要靶点，提示汉黄芩素对DR有显著改善作用。结论 利用网络药理学揭示了汉黄芩素通过多靶点、多通路的形式治疗DR疾病，通过体外细胞实验成功验证了AGE-RAGE信号通路中的核心靶点，为进一步阐释汉黄芩素治疗DR的作用机制提供了科学依据。