一种基于网络药理学和分子对接分析魔芋干预糖尿病机制的方法

摘要

本发明提供一种基于网络药理学和分子对接分析魔芋干预糖尿病机制的方法，首先收集与筛选魔芋活性成分，然后收集活性成分作用靶点及疾病潜在靶点；再筛选蛋白质相互作用分析和关键靶点；再进行GO分析及KEGG富集分析；再构建拓扑学分析及可视化网络图；最后进行分子对接，本发明研究包括数据收集、网络分析与结果验证，获得“成分‑疾病”交集靶点51个；GO分析得出核心靶点参与的生物过程主要有对激素水平等过程的调节；KEGG分析得出涉及到的信号通路包括胰岛素抵抗等；最后通过分子对接证实所筛选的活性成分及关键靶点有效，魔芋可通过多成分、多靶点、多途径进行表达来改善糖尿病，为进一步临床应用提供了理论基础。

说明书

技术领域

本发明涉及中药网络药理学分析技术领域，具体涉及一种基于网络药理学和分子对接分析魔芋干预糖尿病机制的方法。

背景技术

随着人们生活质量的提高和饮食习惯的改变，糖尿病(Diabetes mellitus，DM)已经成为常见病。糖尿病根据是否被胰岛素依赖，而划分为Ⅰ型(是)和Ⅱ型(否)，其中，90％以上的患病者，属于Ⅱ型糖尿病(Type II diabetesmellitus，T2DM)。T2DM患者不仅糖代谢障碍，还可能伴有糖尿病肾病、视网膜病变，血小板减少、心血管疾病突发等一系列危害身体健康的疾病。遗传、胰岛素异常、代谢紊乱是导致该病的关键因素，目前，研究表明肠道微生物也可能影响糖尿病的发展，可见导致糖尿病的因素很多。因此，常规治疗难以预防和治愈。为了实现对它的持续干预，食疗与传统药物相结合的治疗策略应运而生。

网络药理学是近年来常应用于中药及中药复方研究中的一个探究核心成分与功能的方法，可通过对“活性成分-作用靶点-疾病”网络的多层次联系完成对药效物质及机制探寻。中药类保健食品是我国保健食品的重要组成部分，其原料主要来源于“药食同源”类中药，具有食品属性。

分子对接能为药物研究领域提供重要技术，他可以模拟分子间的亲和力、结合方式和结合位点等。通过联系药物成分和作用靶点蛋白，建立其相互作用关系，广泛应用于药物证实与研究领域，能对网络药理学预测结果进行验证。

魔芋，又称为蒟蒻，是一种薯芋类植物，是天南星科一类的通用名称。魔芋作为药食两用性植物。魔芋中的功能因子包括多糖、蛋白质、氨基酸、多酚、维生素、脂肪酸、黄酮、有机酸、神经酰胺等，其中大部分成分在魔芋球茎中。其中大部分成分在魔芋球茎中。经查阅《中药大辞典》，它具有减轻体重、降血压、降血糖、减肥等功效，美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)、美国糖尿病学会(The American DiabetesAssociation，ADA)和欧洲糖尿病研究协会(European Association for the Study ofDiabetes，EASD)均表明魔芋在糖尿病的防治方面具有突出表现，可作为药物的一种新资源，但其作用机制尚不明确，因此魔芋对糖尿病的干预研究和分析可为糖尿病药物的开发提供重要的指导和依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于网络药理学和分子对接分析魔芋干预糖尿病机制的方法，通过结合多种数据库与软件，找寻到魔芋治疗糖尿病的相关活性成分、作用靶点与信号通路，利用分子对接技术成功证实了“成分-靶点”结合性能极好，解决了目前魔芋研究周期长、缺乏系统性、研究目标单一等问题，为今后魔芋入药或是成为降糖食品提供了理论基础。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种基于网络药理学和分子对接分析魔芋干预糖尿病机制的方法，包括如下步骤：

步骤一、收集魔芋活性成分；

步骤二、收集活性成分作用靶点及疾病潜在靶点；将Gl absorption(胃肠道吸收)项为high，Drugikeness(药物相似性)项满足两个以上YES作为筛选活性成分的标准；再分别获取活性成分和靶点，并找寻交集；

步骤三、分析蛋白质相互作用和筛选关键靶点；利用String数据库分析交集靶点，得到蛋白质互作网络图(PPI)，再使用Cytoscape进行PPI关键靶点的筛选；

步骤四、利用Metascape对交集靶点进行GO分析及KEGG富集分析，并将分析结果可视化；

步骤五：构建拓扑学分析及可视化网络图；采用Cytoscape开展拓扑学分析，获得核心活性成分和核心作用靶点，并绘制“药食材-活性成分-靶点-通路-疾病”可视化网络图；

步骤六：进行“活性成分-靶点”分子对接。

作为本发明更优的技术方案：步骤二中筛选出的活性成分输入到SwssTargetPrediction数据库中，Probability*≥0.05的部分为潜在靶点，利用Uniprot数据库将其转化为基因名称，再分别在OMIM和GeneCards中获取疾病靶点，去除重复项。

作为本发明更优的技术方案：步骤三中得到蛋白质互作图，设置大于0.4为评分条件，舍去离散点，即不与其他任何蛋白质产生相互作用的蛋白质节点，得到蛋白质互作网络图(PPI)。

作为本发明更优的技术方案：步骤四中将活性成分-疾病交集靶点输入到Metascape网站中，选择GO MF(细胞组分)、GO BP(生物学过程)、GO CC(分子功能)和KEGG分析，根据p＜0.05条件，得到结果。

作为本发明更优的技术方案：步骤五中利用Cytoscape绘制可视化网络图，其节点大小按照Degree来调节，节点越大，代表其度值越高，关联作用越强，每两个节点之间的连线代表两者有关联。

作为本发明更优的技术方案：步骤六中蛋白质文件导入AutoDock中，要经过去除水分子，加氢等操作；小分子文件进行加氢操作，并确定旋转中心、可旋转键及不可旋转键，最后可通过Analyze插件呈现对接结果，结果可通过PyMOL软件进行分析。

有益效果如下：

本发明首次利用网络药理学构建了魔芋活性成分干预糖尿病的“药食材-活性成分-靶点-通路-疾病”网络图，借助其效率高、速度快的优点，一定程度上弥补了传统临床研究耗时费力等缺点，为魔芋治疗糖尿病作用靶点、通路和机理提供了科学依据，也为研究其他药食材-疾病的作用机理提供了参考。本发明通过网络药理学分析和分子对接结果表明，魔芋可通过多成分、多靶点、多途径进行表达来改善糖尿病，其核心成分能够与关键靶点蛋白形成较为稳定的复合物，为进一步临床应用提供了理论基础。随着药食同源的思想逐渐兴起，如控制饮食，缓解糖尿病的渐进式恶化，饮食与药物相结合，不需要或只需要少量的药物就可以控制血糖和尿糖的水平，魔芋可以作为一种特殊的药用食品来辅助治疗糖尿病，本发明为今后魔芋入药或是降糖食品的研发具有很好的应用价值和市场前景。

附图说明

图1为本发明的魔芋活性成分干预糖尿病作用机制研究流程图；

图2为本发明的“魔芋-糖尿病”交集靶点韦恩图；

图3为本发明的“魔芋-糖尿病”交集靶点蛋白的PPI网络图；

图4为本发明的GO分析富集气泡图；

图5为本发明的KEGG通路富集分析气泡图；

图6为本发明的“魔芋-活性成分-靶点-通路-糖尿病”网络图。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

本实施例提供一种基于网络药理学和分子对接技术分析魔芋活性成分干预糖尿病作用机制的方法，具体如下：

1魔芋成分的收集与筛选

检索相关文献和《中药大辞典》获取魔芋已知各类化学成分，并利用PubChem数据库或化源网进行筛选。

2魔芋活性成分的作用靶点与糖尿病潜在靶点的收集

筛选后成分利用SwssTargetPrediction中的Swiss ADME平台通过二次筛选作为有效的活性成分。将其输入到SwssTargetPrediction数据库中，获取其潜在靶点，利用Uniprot数据库将其转化为基因名称。

分别在OMIM和GeneCards数据库中搜索关键词“Diabetes”，获取疾病靶点，合并去除重复项，得到疾病靶点。使用Venny2.1.0进行绘制“成分-疾病”靶点交集图。

3蛋白质相互作用分析和关键靶点筛选

将交集靶点输入到String数据库中，得到蛋白质互作网络图(PPI)。再将其导入Cytoscape，进行PPI关键靶点的筛选。

4GO分析及KEGG富集分析

将活性成分-疾病交集靶点输入到Metascape网站中，选择GO MF(细胞组分)、GOBP(生物学过程)、GO CC(分子功能)和KEGG分析，根据p＜0.05条件，得到结果。

5拓扑学分析及可视化网络图的构建

采用CytoscapeAnalyzer插件开展拓扑学分析，得到核心活性成分和核心作用靶点。再利用Cytoscape绘制“药食材-活性成分-靶点-通路-疾病”网络图。

6分子对接

利用AutoDock完成分子对接，结果通过PyMOL软件进行分析。

实施例1的魔芋成分的筛选结果：

检索相关文献和《中药大辞典》共获得魔芋的56种活性成分，将它们编号为MY1-MY56，经筛选，最后得到29种有效成分。

实施例1的活性成分疾病交集靶点获取：

由图2可以看出，经合并去重后，活性成分靶点335个，疾病靶点841个，交集靶点为51个。

实施例1的蛋白质相互作用分析关键靶点筛选结果：

将51个交集靶点输入到String数据库中，可得到蛋白质相互作用分析PPI网络图。再将其导入Cytoscape，然后进行PPI关键靶点的筛选，共13个，分别为PTPRC、ACE、TLR4、CXCL8、PPARA、HIF1A、MMP9、STAT3、ESR1、PTGS2、PPARG、VEGFA和AKT1。

据相关研究表明，核受体PPAR家族在能量稳态和代谢功能中发挥着重要的调节作用。PPARs是过氧化物酶体增殖物激活受体，包括PPARα、PPARγ和PPARβ/δ3种亚型。其在肝脏脂质代谢紊乱、炎症、糖代谢失调等方面起重要作用。一般认为，PPARα主要调节能量稳态和脂质代谢，PPARγ能激活引起胰岛素增敏并增强葡萄糖代谢，是葡萄糖稳态的关键调节因子。PTPRC全称为跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶受体C，它是糖尿病的潜在生物标志物，其与妊娠期糖尿病密切相关；ACE为血管紧张素转换酶，具有糖苷酶活性，它的表达与冠心病合并Ⅱ型糖尿病有一定正相关性；TLR4是toll样受体4，toll样受体信号通路是糖尿病的重要病理生理特征，可通过调节TLR4，发挥抗糖尿病作用；CXCL8也被称为白细胞介素-8，它是高糖诱导的糖尿病肾病的重要因子；HIF1A是低氧诱导因子1A，它的多态性对糖尿病和糖尿病并发症起到一定的保护作用；MMP9全称为基质金属蛋白酶9，通过下调MMP9可改善糖尿病周围神经病变的功能；STAT3为信号转导和转录激活因子3单克隆抗体，在STAT3活性正常的情况下，CD8 T细胞对糖尿病的反应受到抑制，从而驱动糖尿病发病；ESR1为雌激素受体，ESR1介导的血糖稳态效应是有益的，ESR2则相反，因此，ESR1/ESR2比值失衡可能在新陈代谢中产生重要影响；PTGS2全称为前列腺素G/H合成酶2，它可破坏胰岛β细胞功能，其在糖尿病治疗中具有潜在价值；VEGFA为血管内皮生长因子A，其与糖尿病和相关疾病的治疗息息相关，抑制高糖诱导的细胞增殖和迁移与VEGFA有关；AKT1全称为RAC-alpha丝氨酸/threonine-protein激酶，它通过介导胰岛素诱导的糖转运来调节糖摄取，是减少糖尿病肾病作用机制之一。

如图3所示为PPI网络图，关键靶点按Degree大小，在最外圈按顺时针方向排列，节点越大，表示该蛋白在网络中发挥的作用越大，越重要。

实施例1的GO及KEGG分析：

GO(Gene Ontology，基因本体)数据库总共有三大类，分别是生物学过程细胞组分和分子功能，其中分子功能集中于呈现基因、蛋白质在分子生物学方面的活性；细胞组分则偏向于表明基因、蛋白质在细胞的哪个部位发挥作用；生物学过程则阐述基因、蛋白参与哪个具有多个分子功能构成的生理过程。根据p＜0.05条件，共得16个CC条目、67个MF条目、790个BP条目。利用气泡图，将富集结果的p值以颜色表示，p越大，气泡的颜色越深；基因数用气泡大小表示，富集的基因数量越多，该气泡越大，Y轴显示内容是条目名称，X轴是富集倍数。GO富集分析结果如图4所示。可以得出魔芋在改善、治疗糖尿病的核心靶点参与的生物过程主要有对激素水平、分泌、细胞内信号转导、血液循环、炎症、小分子代谢、脂质代谢过程的调节等。

KEGG(京都基因与基因组百科全书)分析主要针对于生物体中的代谢通路进行分析，通常会考虑到物种的遗传背景、蛋白质组学数据和基因组学数据等方面的信息，它侧重于寻找和分析生物体系统中的相互作用。图5为KEGG通路富集结果，涉及到的信号通路包括但不限于癌症中的蛋白多糖(Proteoglycansin cancer)、糖尿病性心肌病(Diabeticcardiomyopathy)、胰岛素抵抗(Insulinresistance)、HIF-1信号通路(HIF-1signalingpathway)、脂质和动脉硬化(Lipidand atherosclerosis)、PPAR信号通路(PPAR signalingpathway)、IL-17信号通路(IL-17signaling pathway)、内分泌抵抗(Endocrineresistance)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway indiabeticcomplications)。

据研究表明，蛋白多糖是一类高度糖基化的蛋白质，几乎在所有组织中都有表达，而糖尿病可诱导它的增加和紊乱；糖尿病心肌病(DCM)是一种由糖尿病引起的病理生理状况，高血糖、胰岛素抵抗、高胰岛素血症和游离脂肪酸的代谢增加，是导致患病的原因；胰岛素抵抗是Ⅱ型糖尿病的关键致病因素，糖尿病受到氧化应激和炎症的影响，这是胰岛素抵抗的主要原因，检测并调节其变化可以预防糖尿病的发展；HIF-1是糖尿病并发症的潜在治疗靶点，能激活HIF-1的药物在清除糖尿病患者感染细菌方面发挥治疗作用；糖尿病患者一般有增加的心血管疾病的风险，因此，基于脂质治疗和低密度脂蛋白胆固醇的降低可以治疗糖尿病；PPAR信号通路的激活可以改善糖尿病及其相关疾病的治疗，比如由糖尿病引起的心肌肥厚，通过下调PPAR的表达，能改善血糖；白细胞介素-17a(IL-17)，是一种促炎细胞因子，它是开发抗糖尿病相关药物的潜在靶点，能阻断由胰岛素介导的葡萄糖摄取；晚期糖基化终末产物(AGEs)水平在糖尿病患者中较高，并刺激RAGE(AGE受体)信号通路升高，因此该通路对于改善糖尿病起到显著作用。

实施例1的拓扑学分析结果及可视化网络图的构建：

通过拓扑学分析得到15种核心活性成分，分别为赖氨酸(MY35)、苯丙氨酸(MY34)、3-甲基组氨酸(MY20)、异黄酮(MY48)、组氨酸(MY36)、酪氨酸(MY33)、阿魏酸(MY52)、鼠李糖(MY08)、橙酮(MY50)、5-羟色胺酸(MY39)、桂皮酸(MY53)、二氢黄酮醇(MY49)、黄酮醇(MY47)、棕榈酸(MY43)、β-氨基异丁酸(MY15)。

经文献调研，黄酮类活性成分可改善糖脂质代谢紊乱、相关脂肪性肝病、糖尿病肾病、炎症、氧化应激损伤等由糖尿病引发的一系列疾病；阿魏酸在糖尿病肾病的治疗上已经有了一定的临床基础；β-氨基异丁酸已被证实能改善糖尿病的糖脂代谢异常；糖尿病患者中性粒细胞趋化功能受损，高浓度棕榈酸能对其进行抑制，并且棕榈酸还能抑制中心体扩增，中心体扩增能使非肿瘤细胞演变成肿瘤细胞，此外，棕榈酸能比D-葡萄糖更敏感地刺激某些细胞表达的因子；鼠李糖是一种广泛存在于植物的多糖、糖苷、植物胶和细菌多糖中的一种物质，包括魔芋、茶、蒲公英、仙人掌等，该多糖成分均被证实具有降血糖、改善糖尿病的功效；5-羟色胺4受体激动剂可以抑制糖尿病小鼠结肠黏膜巨噬细胞极化，改善糖尿病结肠神经病变，这可能与其抑制细胞程序性坏死有关。这些都为治疗糖尿病提供了新靶点和新策略。

通过拓扑学分析可得10个核心作用靶点，分别为AR、CYP19A1、AKR1B1、SHBG、TH、PTPN1、KDR、LCK、MMP2和MMP9。

“药食材-活性成分-靶点-通路-疾病”可视化网络图如图6所示，其中菱形表示成分；圆形表示靶点；六边形表示药食材；八边形表示疾病；V形表示通路。度值与节点大小呈正相关，每两个节点之间的连线代表两者有关联。共102个节点，337条边。

实施例1分子对接结果：

利用AutoDockTools对PPI关键靶点筛选中按Degree大小排列的前五个靶点AKT1、VEGFA、PPARG、PTGS2和ESR1与核心成分MY08(鼠李糖)、MY15(β-氨基异丁酸)、MY33(酪氨酸)、MY43(棕榈酸)、MY47(黄酮醇)、MY49(二氢黄酮醇)进行分子对接验证，得到的成分与蛋白靶点之间结果如表1所示。一般认为，若活性成分与靶点蛋白之间的结合能小于0kcal/mol，表明其可以自发结合；若结合能小于-5.0kcal/mol，表明其结合性能好，结合构象越稳定。由表1可知，化合物与靶点蛋白之间的结合能均小于0kcal/mol，表格中所有化合物与靶点蛋白之间的结合能小于-5.0kcal/mol，表明结合构象很稳定，也表明本试验所筛选的活性成分及关键靶点有效。

表1部分成分与关键靶点分子对接结果

综上所述，本发明通过网络药理学筛选并分析魔芋活性成分关于治疗糖尿病的核心活性成分及其作用机制。经拓扑学分析共得到赖氨酸、苯丙氨酸、3-甲基组氨酸、异黄酮等15种核心活性成分；MMP9、MMP2、LCK、KDR等10个核心作用靶点。经蛋白质相互作用分析获得AKT1、VEGFA、PTGS2、ESR1等13个关键靶点互作蛋白。通过GO功能富集分析可以得出核心靶点参与的生物过程主要有对激素水平、分泌、小分子代谢、脂质代谢过程的调节等；KEGG通路富集分析表明魔芋治疗糖尿病可能与胰岛素抵抗、HIF-1信号通路、PPAR信号通路、IL-17信号通路、内分泌抵抗、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等有关。将网络药理学分析得到的核心活性成分与关键靶点蛋白进行分子对接，从结果可以看出，他们之间都可以自发结合且结合构象稳定。其中β-氨基异丁酸与PPARG的结合亲和力最高，结合能为-8.07kcal/mol，此外，AKT1蛋白与黄酮醇，VEGFA和ESR1蛋白与二氢黄酮醇也具有较好的亲和力。这些均表明，魔芋改善糖尿病的生物学过程，是多成分、多靶点、多通路的。