产气荚膜梭菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

摘要

旨在建立一种高效、快速、准确的检测产气荚膜梭菌并分型的多重PCR方法。根据GenBank上公布的产气荚膜梭菌α、β、ε、ι毒素的基因序列，设计、合成4对针对4种毒素的特异性引物。并通过改变引物浓度、退火温度等反应条件，对多重PCR方法进行优化。结果显示，对产气荚膜梭菌α、β、ε、ι毒素基因均扩增出了预期大小的目的条带，而金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、停乳链球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌均未出现条带；当核酸质量浓度降至12.5μg/L时，仍可清晰地扩增出α、β、ε、ι毒素基因对应条带。在核酸质量浓度降至3.12μg/L时，仍可观察到α与ε毒素基因扩增出的条带。在核酸质量浓度降至0.78μg/L时，α毒素基因对应的条带仍可隐约可见。应用该方法对68份疑似产气荚膜梭菌导致猝死的牛鼻拭子样进行检测，其中有52份样品检测结果显示为C型产气荚膜梭菌，剩余16份样品均为非产气荚膜梭菌，阳性率为76%。结果表明，本研究建立的多重PCR方法特异性强、灵敏度高重复性好，可准确地鉴别区分5种类型的产气荚膜梭菌。在采样时仅需采取疑似病畜的鼻拭子，操作简便、快捷、安全。对临床检测病畜的产气荚膜梭菌病有较为重要的意义。