SQSTM1蛋白在嗜肺军团菌感染RAW264.7细胞自噬中的作用机制

摘要

目的以SQSTM1蛋白(P62)基因敲除及过表达的RAW264.7小鼠巨噬细胞为研究对象,建立嗜肺军团菌感染巨噬细胞模型,观察细胞内细菌增殖情况以及自噬流和自噬小体的变化,检测自噬相关因子表达水平变化,探讨P62在嗜肺军团菌感染RAW264.7巨噬细胞自噬中的作用机制。方法嗜肺军团菌以感染复数10、50和100感染RAW264.7巨噬细胞组、KO-P62细胞组、OE-P62细胞组,同时以未加嗜肺军团菌感染作为对照组;细菌增殖实验观察嗜肺军团菌在巨噬细胞内的增殖情况;透射电镜观察嗜肺军团菌与细胞共培养12 h时RAW264.7巨噬细胞组、KO-P62细胞组、OE-P62细胞组的自噬小体、自噬溶酶体及相关细胞器等超微结构;pmCherry-C1-EGFP-LC3B双荧光指示系统检测巨噬细胞自噬流的变化;采用免疫印迹试验(Western blotting)及实时荧光定量(RT-qPCR)法检测RAW264.7巨噬细胞组、KO-P62细胞组、OE-P62细胞组P62、自噬相关基因AMBRA1、溶酶体关联膜蛋白2(LAMP2)、自噬相关蛋白5(Atg5)、自噬效应蛋白1(Beclin1)、自噬微管相关蛋白轻链3(LC3B)的表达水平。结果细菌增殖实验检测在RAW264.7细胞组内嗜肺军团菌的数量随着时间的增长逐渐增长,在KO-P62细胞组及OE-P62细胞组内嗜肺军团菌的数量随着时间的增长均逐渐减少;透射电镜可观察到嗜肺军团菌感染RAW264.7细胞组后,自噬小体及自噬溶酶体减少,与RAW264.7细胞组相比,KO-P62细胞组及OE-P62细胞组自噬小体及自噬溶酶体均增多;pmCherry-C1-EGFP-LC3B双荧光指示系统检测自噬流结果显示,嗜肺军团菌感染RAW264.7细胞组,自噬流均减弱,KO-P62细胞组及OE-P62细胞组自噬流增加;Western blotting及RT-qPCR结果显示,与RAW264.7细胞组相比:KO-P62细胞组Beclin1先升高后降低,P62基本不表达,LC3Ⅱ/Ⅰ比值、AMBRA1、LAMP2及Atg5蛋白表达均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);OE-P62细胞组Beclin1先降低后升高,P62、AMBRA1、LAMP2、Atg5及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明显上调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论敲除、过表达P62均可抑制嗜肺军团菌在RAW264.7巨噬细胞内的增殖,促进自噬,其机制可能与Atg5-P62-AMBRA1信号通路有关。