野生型及跨膜型肿瘤坏死因子真核表达载体构建及其对心肌细胞凋亡的影响

摘要

目的构建鼠野生型肿瘤坏死因子(Wild type tumor necrosis factor-alpha,wtTNF-α)和跨膜型肿瘤坏死因子(Transmembrane tumor necrosis factor-alpha,tmTNF-α)基因真核表达载体,转染心肌细胞,比较两型TNF-α对心肌细胞凋亡的影响。方法应用RT-PCR方法从小鼠腹腔巨噬细胞中扩增wtTNF-α基因编码区,根据小鼠TNF氨基酸序列设计缺失肿瘤坏死因子转化酶(TNF alpha converting enzyme,TACE)作用位点(缺失1-12位氨基酸)的突变引物,通过重叠PCR得到构建不被TACE剪切的TNF-α突变体,即跨膜型肿瘤坏死因子tm TNF-α,扩增得到的wt TNF-α,tm TNF-αPCR产物经EcoR I+BanH I双酶切后克隆到pIRES2-EGFP真核表达载体中并转染入大鼠H9c2(2-1)心肌细胞,用RT-PCR及Western Blot方法鉴定转染效率及不同表达载体对心肌细胞凋亡的影响。结果成功构建pIRES2-eGFP-wtTNF和pIRES2-eGFP-tmTNF真核表达载体并转染大鼠H9c2(2-1)心肌细胞,tmTNF-α对心肌细胞无明显促凋亡作用,而wtTNF-α可以诱导心肌细胞凋亡。结论由于wtTNF-α可被酶解产生sTNF-α,提示sTNF-α,而并非跨膜型TNF-α对该心肌细胞株具有诱导凋亡的作用。