香烟烟雾暴露后的雄性大鼠睾丸差异性microRNA的筛选及功能验证

摘要

目的:筛选香烟烟雾暴露后的雄性大鼠睾丸组织差异性表达的miRNA,寻找并鉴定吸烟所致睾丸凋亡损伤的早期分子标记物。方法:200只清洁级SD雄鼠,随机分为10支/d、20支/d、30支/d香烟烟雾暴露组和对照组(n=10),采用静式染毒法分别处理2、4、6、8和12周后,通过HE染色观察睾丸组织病理学变化,运用TUNEL法检测睾丸细胞凋亡情况,免疫组化法检测Caspase-3的表达,RT-PCR法和Western印迹检测Caspase-9的mRNA及蛋白表达。根据以上结果选择12周高剂量组与对照组各4个睾丸样本进行miRNA芯片筛选及生物信息学分析,运用RT-PCR法在所有受试动物中对差异性miRNA的表达进行验证。结果:与对照组相比,随香烟烟雾暴露剂量和时间的增加,暴露组大鼠睾丸组织逐渐出现萎缩等改变;染毒第6周起,睾丸凋亡细胞数量明显增多(P<0.05);大鼠睾丸Caspase-3的表达从第6周中剂量组开始显著升高(P<0.01);Caspase-9 mRNA和蛋白表达水平上调(P<0.05);芯片筛选结果发现暴露组大鼠睾丸差异性表达的miRNA有5条,其中miR-138-5p、miR-181d-5p、miR-19a-3p及miR-3588表达下调,miR-155-5p表达上调,RT-PCR验证结果与芯片结果一致。且差异性miRNA的靶基因的主要功能为正向调节细胞凋亡。结论:miR-155-5p、miR-138-5p、miR-181d-5p、miR-19a-3p及miR-3588在吸烟所致睾丸凋亡损伤中存在调控作用,并有望成为吸烟所致精子发生受阻的早期诊断和预测预后的生物标志物。