基于时间分辨荧光免疫技术的VEGFR-2酪氨酸激酶抑制剂筛选模型的建立及应用

摘要

利用原核表达系统表达重组蛋白VEGFR-2 TK,通过Ni-NTA亲和层析柱纯化获得目的蛋白,以VEGFR-2 TK作为靶点,以TRFIA技术作为检测手段,对反应条件进行优化(底物浓度,ATP,离子浓度),建立针对VEGFR-2酪氨酸激酶的高通量药物筛选模型。选取已报道的VEGFR-2酪氨酸激酶抑制剂SU11248对该药物筛选模型进行验证。成功表达及纯化获得高活性VEGFR-2 TK重组蛋白,然后经过优化获得高通量药物筛选模型反应条件:VEGFR-2 TK最适浓度为250ng/孔,底物PolyE4Y的最佳浓度为10μg/ml,ATP的最佳浓度为60μmol/L,Mg^(2+)的最佳浓度为40μmol/L,Mn^(2+)的最佳浓度为20μmol/I。用已知VEGFR-2 TK抑制剂SU11248对模型进行验证,IC_(50)为141.6 nmol/L,与文献中报道一致。成功构建VEGFR-2酪氨酸激酶抑制剂筛选模型,其灵敏度高,结果稳定,适用于高通量药物筛选。