免疫共沉淀检测人p65和SMRT蛋白间相互作用

摘要

目的使用免疫共沉淀技术法检测人p65和SMRT蛋白在儿童急性髓细胞白血病(AML)细胞株THP-1中相互作用。方法体外人工合成p65基因CDS区碱基序列和SMRT-C645bp对应的基因片段,分别克隆至pUC57载体,经酶切、测序正确后,PCR扩增目的基因片段,酶切后亚克隆至带有HA标签和Myc标签的真核表达载体pCMV-HA和pCMV-Myc,测序、酶切鉴定正确后,共转染THP-1细胞,免疫共沉淀法检测二者间相互作用。结果成功构建了人p65和SMRT蛋白真核表达载体pCMV-HA-p65和pCMV-Myc-SMRT,共转染THP-1细胞,抗HA和Myc多克隆抗体分别沉淀细胞裂解液,用抗Myc和HA单克隆抗体分别进行Western Blotting检测,可以检测到HA-p65和Myc-SMRT蛋白的表达。结论成功构建了人p65和SMRT蛋白重组真核表达载体,在THP-1细胞株中表达后,免疫共沉淀证实p65和SMRT蛋白间存在相互作用,为进一步探讨儿童AML发病机制和白血病的靶向治疗提供理论依据。