链球菌溶血素与真菌果胶酶融合表达及纯化条件的优化

摘要

目的优化链球菌溶血素（streptolysin O,SLO）与真菌果胶酶（pectin lyase,PL）的融合表达及纯化条件。方法将活化培养的工程菌以2%接种量接种于发酵液体培养基中,于37℃,200 r/min培养至不同生长期（A_（600）值分别为0.6、0.8和1.0）,分别于不同温度（10、15、20、25、30、35和37℃）及加入不同终浓度IPTG（0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8和1.0 mmol/L）条件下诱导表达不同时间（6、12、20、24、36、48和60 h）。将诱导表达的融合蛋白进行Ni离子亲和层析纯化,对纯化中的上样缓冲液（binding buffer,分别含0、5、10、15、20、25、30 mmol/L咪唑）、清洗缓冲液（washing buffer,分别含0、5、10、20、30、40、50、60 mmol/L咪唑）及洗脱缓冲液（elution buffer,分别含100、200、500、1 000 mmol/L咪唑）的咪唑浓度进行优化。结果最佳诱导表达条件为：工程菌培养至A_（600）为0.8时,加入0.4 mmol/L IPTG,于20℃诱导24 h,目的蛋白的相对分子质量约91 500,占全菌总蛋白的38.6%,溶血活性可达4.0×10~7U/ml。最佳纯化条件为：binding buffer和washing buffer最佳咪唑浓度为5和60 mmol/L,elution buffer分别使用200和500 mmol/L咪唑进行阶段性梯度洗脱,纯化产物纯度可达95%。结论成功优化了SLO与PL融合蛋白的表达及纯化条件,纯化后获得了纯度较高的融合蛋白,为进一步研究SLO蛋白的性质及应用奠定了基础。