黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

摘要

目的:建立黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。方法:体外转录黄热病病毒3-UTR的部分序列核酸作为阳性对照模板,设计实时荧光RT-PCR不同的反应程序和引物/探针浓度的组合,摸索最佳反应体系条件,并用于黄热病疫苗的检测。结果:建立的黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法最佳反应体系为:正向引物YFV-FP终浓度500 nM,反向引物YFV-RP终浓度750 nM,探针YFV-Probe终浓度250 nM;Roche lightcycler仪器适用的扩增程序为:45℃10 min,95℃10 min;95℃5 s,60℃20 s 45次循环。该方法最低检测限约为2copies病毒/反应,与登革病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、基孔肯雅病毒等蚊媒病毒无交叉反应。应用该方法对黄热病疫苗进行检测,结果为核酸阳性。结论:该实时荧光RT-PCR方法灵敏度高,特异性强,适用于黄热病病毒的快速检验。