枫香ISSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

摘要

为探索最适的枫香叶片DNA提取方法、最优ISSR引物和最佳ISSR-PCR扩增反应体系,本试验采用改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、十二烷基硫酸钠(SDS)法、高盐低pH法和试剂盒法提取枫香叶片DNA;采用三因素五水平(DNA模板用量,2×Taq Master Mix用量引物浓度)正交试验构建并优化枫香的ISSR-PCR反应体系;对100条ISSR引物进行筛选及其退火温度优化。结果表明:改良CTAB方法提取的DNA浓度高,且电泳条带清晰无污染;SDS和试剂盒方法提取DNA的浓度低,电泳条带亮度低;高盐低pH值法提取的DNA的电泳条带模糊且降解拖尾现象严重。DNA模板浓度为20 ng、Taq Master Mix用量为10μL、引物浓度为0.6μmol/L、ddH2O为7.8μL时扩增程序的条带最清晰、多态性最好。筛选出17条重复性强、条带清晰明亮、多态性高的ISSR引物及其最适退火温度,其中扩增位点数最多的为引物UBC-834、UBC-836和UBC-853,扩增位点均为13个,以UBC-878为ISSR引物时的扩增反应中,当退火温度在46.9℃的时候能够扩增出较多明亮且清晰的条带。枫香叶片DNA最适提取方法为改良CTAB法;ISSR-PCR扩增程序的最优反应体系为20μL:模板DNA浓度为20 ng、Taq Master Mix用量为10μL、引物浓度为0.6μmol/L、ddH2O 7.8μL;筛选出17条最适枫香的ISSR候选引物及其最适退火温度。该枫香ISSR-PCR优化体系和候选引物适用于分子标记为枫香遗传多样性与亲缘关系作分析。