人核因子κBp65核定位信号缺失突变对A549细胞恶性表型的影响

摘要

目的鉴定人核因子κB(NF-κB)p65核定位信号(NLS)缺失突变质粒即pc DNA3.1(+)-NF-κBp65ΔNLS(简称NF-κBp65ΔNLS)的表达功能,以及其对低表达NF-κBp65的A549细胞株即A549/NF-κBp65 shRNA细胞增殖、迁移和粘附能力的影响。方法培养人A549/NF-κBp65 shRNA细胞株,分为对照组、转染pc DNA3.1(+)组、转染NF-κBp65ΔNLS组。应用间接免疫荧光、实时荧光定量-PCR和Western blot技术检测NF-κBp65的细胞内定位及mRNA、蛋白表达水平的变化;应用MTT、Transwell和细胞粘附实验分析转染NF-κBp65ΔNLS质粒对A549/NF-κBp65 shRNA细胞增殖、迁移、粘附能力的影响。结果成功构建人NF-κBp65ΔNLS真核表达质粒。转染NF-κBp65ΔNLS质粒的A549/NF-κBp65 shRNA细胞与对照组及转染pc DNA3.1(+)组比较,NF-κBp65 mRNA表达水平明显上调(10.63±0.84比1.04±0.21和1.23±0.22,P<0.01),NF-κBp65蛋白表达水平明显升高(1.07±0.06比0.53±0.02和0.59±0.04,P<0.01),且NF-κBp65蛋白主要位于细胞浆内,在肿瘤坏死因子α刺激后NF-κBp65蛋白并未明显进入细胞核。与对照组及转染pc DNA3.1(+)组比较,转染NF-κBp65ΔNLS质粒的A549/NF-κBp65 shRNA细胞的增殖、迁移和粘附能力均有不同程度增强。结论通过基因突变技术构建无NLS的NF-κBp65真核表达质粒,可明显增强A549/NF-κBp65shRNA细胞株内NF-κBp65 mRNA和蛋白的表达水平,并使NF-κBp65蛋白定位于细胞浆内;同时,细胞浆内过表达NF-κBp65ΔNLS蛋白可明显增强A549/NF-κBp65 shRNA细胞的增殖、迁移和粘附能力,提示滞留于细胞浆内的NF-κBp65仍可通过影响NF-κB信号通路相关蛋白参与调节肺癌细胞的生物学行为。