弓形虫B1基因实时荧光定量PCR无创检测方法的建立及临床初步应用

摘要

目的:建立可用于检测无创标本尿液中弓形虫DNA的TaqMan实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time-FQ-PCR)并初步评价其临床应用价值。方法:根据登录GenBank的弓形虫B1基因序列,设计1对引物和1条TaqMan探针。提取感染弓形虫小鼠尿液总弓形虫DNA,先用普通PCR扩增目的基因片段,将回收产物与PMD-18T载体连接。经测序证实为目的片段后,制备系列浓度参照物,优化FQ-Real-Time-PCR反应体系,并对灵敏度、重复性、特异性、线性、探针稳定性进行评价。检测3份外周血全血中弓形虫DNA阳性者的尿样,再作初步临床应用评价。结果:成功构建尿液中弓形虫DNA参照物,灵敏度为弓形虫DNA 104拷贝/ml。批内变异系数(CV)为2.42%,批间CV为4.18%。线性为103～107拷贝/ml,特异性100%。检测3份外周血弓形虫DNA阳性就诊者的尿样,阳性率为100%(3/3)。结论:用Real-Time-FQ-PCR能检测小鼠尿液弓形虫DNA和人尿液弓形虫DNA,该方法具有方便、灵敏、特异、结果重复性好等优点。