鼠尿液中弓形虫B1基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

摘要

根据GenBank中弓形虫B1基因序列,设计1对引物和1条TaqMan探针。从感染弓形虫小鼠尿液提取弓形虫总DNA,先用普通PCR扩增获得目的基因产物,将纯化的回收产物与pMD18-T载体连接,测序证实为目的片段后,制备系列浓度参照品。再优化实时荧光定量PCR反应体系,并对体系的灵敏度、重复性、线性、特异性和参照品稳定性进行评价。其灵敏度为104拷贝/ml;批内变异系数为2.42%,批间变异系数为4.18%,线性为103～107拷贝/ml,特异性为100%,参照品稳定。该法检测鼠尿样弓形虫DNA具有方便、灵敏、特异和重复性好等优点。