基于miR30的靶向DcR3慢病毒干扰载体的构建及鉴定

摘要

目的 构建基于miR30的靶向DcR3慢病毒干扰载体.方法 人工设计针对DcR3编码区的干扰序列,使其转录后RNA结构类似于miR30结构,茎杆序列替换成DcR3 序列,送上海生物工程技术服务有限公司合成.以该序列为模板,分别利用携带EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物行PCR扩增,通过酶切连接的方式将插入片段连入p201慢病毒载体骨架中.经酶切和测序鉴定后,用包装质粒pMD2G及包膜质粒psAX2共同转染293FT细胞进行病毒包装.病毒包装上清液加入培养的人食管鳞癌细胞系KYSE150细胞中,用FACS分选后进行RT-PCR和Western blot检测DcR3表达情况.结果 构建了针对DcR3 的3条慢病毒干扰载体,成功包装出病毒,并不同程度地抑制了DcR3蛋白的表达.结论 基于miR-30的DcR3能有效抑制DcR3表达,为进一步研究DcR3 功能打下了基础.