T7启动子介导体外构建Nucleostemin特异性短发夹状干扰RNA

摘要

目的体外构建合成针对Nucleostemin(核干细胞因子,NS)基因的短发夹状干扰RNA(shRNA),用于进一步研究以该基因为靶目标、RNA干扰(RNA interference,RNAi)为手段的白血病基因治疗可行性.方法从Nucleostemin基因的三个变异体cDNA共同序列中筛选出2个3'端为AA的21个碱基片段作为shRNA合成的对应序列,9个碱基的5'-UCUCUUGAA-3'作为Loop环.以23个碱基的5'-GGATCCTAATACGACTCACTATA-3'作为T7启动子(T7 Promoter)序列,构建shRNA的体外合成双链DNA模板,一条链5'端无AA,顺序为启动子、shRNA正义信息链、Loop环、shRNA反义信息链,共70个碱基;另一条是该链的互补链,5'端带有AA,共72个碱基.在T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase)作用下合成shRNA,纯化后通过凝胶电泳比较灰度值确定shRNA浓度;shRNA作用于HL-60细胞,通过观察细胞形态变化和NS-mRNA抑制率验证干扰效果.结果体外合成的两条shRNA电泳无降解和弥散现象,浓度分别为5.24 μmol·L-1和3.35 μmol·L-1;干扰HL-60细胞48 h后,细胞密度和聚集程度下降,细胞之间大小相差悬殊,经shRNA-NS-2作用的HL-60细胞一部分由圆形变成了梭形并有明显的伪足;与对照组相比NS-mRNA抑制率分别达到37.82%和71.88%.结论体外成功构建和合成了两条针对Nucleostemin基因的shRNA,且抑制该基因表达的作用明显,shRNA-NS-2使HL-60细胞形态发生了改变.所合成的shRNA-NS-2可作为进一步研究该基因和探索白血病的基因治疗的工具.