蟾毒灵对食管癌增殖的影响及机制研究

摘要

目的探讨蟾毒灵对食管癌增殖的影响,并初步探讨其可能分子机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和乳酸脱氢酶细胞毒性检测法(LDH Assay Kit)检测蟾毒灵对食管癌细胞株KYSE-70活力的影响。通过细胞克隆形成法和EdU(5-ethynyl-2-deoxyuridine)细胞增殖实验研究蟾毒灵对KYSE-70细胞增殖的抑制作用。利用DAPI染色、TUNEL、流式细胞术检测蟾毒灵对KYSE-70细胞凋亡的影响。采用实时荧光定量PCR技术(quantitative real time-PCR,qPCR)、蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax、NF-κBp65、NF-κB p65 mRNA和蛋白表达水平的变化。通过JC-1荧光探针试剂盒和ATP检测试剂盒研究蟾毒灵作用后对KYSE-70线粒体功能的影响。最后,利用裸鼠体外成瘤实验研究蟾毒灵在体内对食管癌生长的影响。结果MTT和LDH实验结果表明,蟾毒灵对KYSE-70细胞活力具有明显的抑制作用。克隆形成实验和EdU结果表明,蟾毒灵可显著抑制KYSE-70细胞增殖。DAPI染色结果显示,蟾毒灵处理后KYSE-70细胞的核出现染色质不均匀、浓缩、聚集及碎裂等凋亡形态。TUNEL染色和流式细胞检测结果显示,蟾毒灵作用后可促进KYSE-70细胞凋亡。qPCR和Western blot结果显示,蟾毒灵处理后KYSE-70细胞内Bcl-2表达下调,Bax表达上调,Bax/Bcl-2表达比例升高。另外,蟾毒灵作用后,KYSE-70细胞的线粒体膜电位呈现明显的下降趋势(P<0.01),ATP的生成量也显著减少。裸鼠体外成瘤实验表明,蟾毒灵能够明显抑制体内肿瘤的生长。结论蟾毒灵能通过抑制食管癌的增殖,并通过线粒体途径促进食管癌细胞凋亡。