基于JAK2/STAT3信号通路探讨雷公藤甲素诱导宫颈癌耐药细胞自噬性死亡的机制

摘要

目的探讨雷公藤甲素(triptolide,TPL)增敏顺铂(cisplatin,DDP)促进宫颈癌耐药细胞自噬性死亡的作用机制。方法体外构建人宫颈癌DDP耐药细胞株HeLa/DR,分为空白组、DDP(10μg·mL^(-1))组、TPL组(50 nmol·L^(-1))、DDP+TPL组用于药效学研究;分为TPL组、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC,5 mmol·L^(-1))组、TPL+NAC组、Janus激酶2/信号转导与转录激活因子3(JAK2/STAT3)抑制剂AG490(8μg·mL^(-1))组、TPL+JAK2/转录信号传导子和激活子3(STAT3)激活剂RO8191(20μmol·L^(-1))组用于机制研究。采用CCK-8法检测细胞增殖率,计算半数抑制浓度(IC50)和药物敏感度指数(SI),采用中位药效法(chou-talalay)计算DDP和TPL联合用药指数(CI)。采用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布;采用MitoTracker green和DQ BSA red染色观察溶酶体数量和吞噬功能;采用GFP-LC3和MitroTracker共定位染色法观察线粒体自噬体数量。Western blot法检测相关蛋白表达。结果TPL剂量≤200 nmol·L^(-1)时,CI<1,与DDP具有协同作用;50 nmol·L^(-1)TPL与DDP的协同作用最显著,可增加HeLa/DR细胞对DDP、5-氟尿嘧啶和紫杉醇的敏感性(SI=8.05±0.28,3.17±0.14,4.05±0.12)。与DDP组相比,TPL+DDP组细胞凋亡率和G0/G1期细胞比例明显升高(P<0.05)。此外,虽然LC3-Mitro共定位绿色荧光增多且线粒体总蛋白中LC3-II/LC3-I比值和Beclin1蛋白表达升高(P<0.05),但是DQ BSA red/Lysotracker green荧光比值降低(P<0.05)。与空白组相比,TPL组HeLa/DR细胞的2′,7′-二氯荧光素(DCF)荧光强度明显升高,而加入NAC后可显著降低活性氧(ROS)生成量,同时Beclin蛋白相对表达量和LC3-II/LC3-I蛋白比值降低。网络药理学揭示了TPL-宫颈癌-JAK2/STAT3通路之间的关系。Western blot结果显示,与空白组相比,TPL组、AG490组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达比值明显降低,但是TPL+RO8191组和TPL+NAC组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达比值则较TPL组升高(P<0.001)。结论TPL通过诱导ROS产生抑制JAK2/STAT3信号通路,同时促使线粒体损伤并破坏DDP作用建立的线粒体-溶酶体交互作用,从而协同DDP诱发HeLa/DR细胞自噬性死亡。