产毒型O1群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan PCR的临床应用前研究

摘要

目的 探讨产毒型O1 群霍乱弧菌实时荧光双重TaqManPCR 法对临床模拟标本检测的意义,为该法的临床应用提供可靠的技术依据.方法 将O1 群霍乱弧菌灭活菌株悬液[1.0 × 1011 CFU(菌落形成单位)/ml]连续10 倍稀释后与健康成人新鲜粪便混匀,制备成5.0 × 101～5.0 × 109 CFU/g 梯度浓度的模拟带菌者粪便标本并提取DNA,用以评价产毒型O1 群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan PCR 法对临床模拟标本检测的灵敏度、特异性和稳定性.结果 实时荧光双重TaqMan PCR 法对O1 群霍乱弧菌的模拟带菌者粪便标本的检测灵敏度为1.0 × 103 CFU(5.0 × 104 CFU/g)每反应体系,其检测线性范围为1.0 ×103～1.0 × 108 CFU 每反应体系;在稳定性评价中,对含菌量1.0 × 103～1.0 × 108 CFU 每反应体系模拟带菌者粪便标本DNA 进行3 次重复检测的结果 显示,ctxA 基因扩增反应Ct 值的变异系数为0.54%～1.36%,rfb-O1 基因扩增反应Ct 值的变异系数为1.65%～3.75%;在特异性评价中,3 名健康成人新鲜粪便标本的阴性对照均未见特异性扩增曲线.结论产毒型O1 群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan PCR法可用于O1 群霍乱弧菌临床粪便标本的检测.