肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA与IntiminC300融合蛋白的构建表达

摘要

目的 构建表达肠血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7 Ⅲ型分泌蛋白EspA与紧密粘附素C-端免疫保护性片断(IntiminC300)的融合蛋白(EspA-IntiminC300).方法 采用PCR技术从EHEC O157∶H7基因组中扩增EspA的编码基因espA及IntiminC300的编码基因eaeC300,T-A克隆后依次构建至表达载体pET-28a(+),转化宿主细胞E.coli BL21(DE3),测序鉴定,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测其表达量及表达形式,亲和层析法纯化目的蛋白,免疫印迹分析免疫反应性.结果 PCR法自EHEC O157∶H7基因组中分别扩增出了约580bp(espA)和900bp(eaeC300)的目的片段,将二者融合构建了重组质粒pET-28a(+)-espA-eaeC300,测序结果与理论预测值一致性为99.9%(1501/1502).融合蛋白在工程菌中表达量约40%,PAGE初步测定目的蛋白的相对分子量(Mr)约54×103 Da,破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达,包涵体洗涤后纯化,获得目的蛋白纯度约90%.免疫印迹显示融合蛋白能分别与兔抗EspA和IntiminC300血清发生免疫反应.结论 高效表达了融合蛋白(EspA-IntiminC300),此融合蛋白具有良好的免疫反应性和免疫原性,为研制EHECO157∶H7多亚单疫苗奠定了基础.