弓形虫三磷酸核苷水解酶-II的克隆、表达及初步应用

摘要

目的 探讨弓形虫RH株速殖子NTPase-II重组蛋白的免疫反应性及其在抗体检测中的应用.方法 通过PCR获得NTPase-II基因,克隆入pGEM-T Easy载体,经酶切与测序鉴定后亚克隆至表达质粒pBAD-HisB,构建原核表达重组质粒,在大肠杆菌中以包涵体形式获得高效表达.SDS-PAGE和Western-blot分析蛋白表达产物.用纯化的表达产物作为诊断抗原,通过对反应条件的优化,初步建立检测抗NTPase-II抗体的间接ELISA方法.结果 PCR扩增得到特异的弓形虫NTPase-II基因序列,经测序鉴定无基因突变.重组质粒诱导表达产物相对分子量约70kD,与理论值相符.经Western-blot证实,重组蛋白可刺激机体产生相应的抗体.具有良好的抗原性和免疫原性.用表达的重组NTPase-II蛋白初步建立了用于NTPase-II抗体检测的间接ELISA方法.结论 重组NTPase-II蛋白具有较强免疫原性,可作为诊断抗原用于急性弓形虫感染诊断试剂的研发.