弓形虫荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

摘要

根据GenBank中龚地弓形虫529 bp重复序列设计引物,以弓形虫RH株基因组DNA为模板,常规PCR扩增出长度212 bp的特异性保守序列,将其克隆到pGEM-T Easy载体中构建重组质粒标准品;以10倍倍比稀释的质粒标准品为模板,进行SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立弓形虫荧光定量PCR检测方法.将该方法用于临床病死猪的弓形虫检测.结果表明:用重组质粒制作的标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,溶解曲线特异相关系数0.997,平均试验间变异系数2.30％,能检出约0.05个速殖子;检测弓形虫YZ-1株与YZ-2株均为阳性,而检测水牛梭形肉孢子虫、犬等孢球虫、柔嫩艾美耳球虫基因组DNA均为阴性;检测24头病死猪,弓形虫阳性率为70.8％,略高于常规PCR方法的检出率(66.7％),但检测的69个组织样品中,荧光定量PCR方法的检出率(50.7％)明显高于常规PCR方法的检出率(34.8％).